2025年3月发表于

Neural Regeneration Research

摘要

目前缺血性中风的治疗策略还未达到神经功能恢复的预期目标，因此迫切需要开发新的治疗方法。外泌体是一种天然的细胞衍生囊泡，在生理和病理条件下介导细胞间的信号转导。它们具有免疫原性低、稳定性好、输送效率高、能穿过血脑屏障等特点。外泌体的这些生理特性有可能为缺血性中风的治疗带来新的突破。纳米技术的快速发展推动了工程化外泌体的应用，可以有效提高靶向性、增强治疗效果并最大限度地减少所需剂量。技术的进步也推动了外泌体的临床转化研究。在这篇综述中，我们描述了外泌体的治疗效果及其在当前缺血性中风治疗策略中的积极作用，包括其抗炎、抗凋亡、自噬调节、血管生成、神经生成和减少神经胶质瘢痕形成的作用。然而，值得注意的是，尽管外泌体具有巨大的治疗潜力，但仍然缺乏能够产生高纯度外泌体的标准化表征方法和有效的分离技术。未来的优化策略应优先考虑探索合适的分离技术和建立统一的工作流程，以有效利用外泌体进行缺血性中风的诊断或治疗应用。最终，我们的综述旨在总结我们对基于外泌体的缺血性中风治疗前景的理解，并为开发基于外泌体的疗法提供创新思路。

介绍

中风是一种毁灭性疾病，是全球第二大死亡和残疾原因。中风的特征是脑部血液供应中断，进一步分为两种类型：缺血性和出血性。随着治疗方式的重大进展，越来越多的患者在中风后幸存下来。然而，由于血脑屏障 (BBB) 的保护强度，许多药物无法到达中枢神经系统 (CNS)。此外，许多幸存者患有严重的神经系统后遗症，如认知障碍、偏瘫和失语症，这可能与缺乏有效的中枢神经系统靶向药物来限制或修复卒中后脑内神经炎症、免疫反应和血管损伤的发展有关。尽管各种指南推荐静脉溶栓和机械血栓切除术作为有效的治疗方法，但它们的应用受到治疗窗口狭窄的限制。此外，这些方法可能导致严重的并发症，例如脑出血和缺血/再灌注损伤。因此，迫切需要提高药物穿过血脑屏障的能力并降低现有治疗并发症的严重程度。

外泌体是细胞外囊泡的一个亚种，直径为40至160纳米。它们最早是由研究人员在观察绵羊网织红细胞成熟为红细胞过程中的转铁蛋白受体命运时发现的，并于1987年被命名为“外泌体”。随后，人们发现人体各个器官、组织和细胞都会释放外泌体。外泌体可广泛存在于血液、唾液、腹水和脑脊液中。

尽管外泌体的研究已有30多年的历史，但其生物学功能仍不清楚。外泌体作为天然纳米材料，可以通过蛋白质、脂质、核酸等物质在细胞间传递信息。与脂质体或合成纳米材料相比，外泌体具有免疫原性低、稳定性好、传递效率高等特点。更重要的是，它们可以穿过血脑屏障。血脑屏障是由脑微血管内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞、基底膜和紧密连接组成的一道严密的屏障。血脑屏障严格调控血液和大脑之间物质的运输，保护中枢神经系统免受伤害，但阻止许多药物进入中枢神经系统。越来越多的研究探索了外泌体穿过血脑屏障的机制。Joshi 和 Zuhorn (2021) 发现，源自 C17.2 神经干细胞 (NSC) 的外泌体通过硫酸肝素蛋白聚糖与脑内皮细胞相互作用，最终通过内吞作用穿过血脑屏障。此外，外泌体通过调节炎症、细胞凋亡和神经血管再生在缺血性中风 (IS) 后治疗中发挥重要作用。尽管外泌体具有天然的脑归巢能力，但动物实验证明其靶向能力低下，并且已使用多种工程技术来修饰外泌体以提高其靶向效率。

本综述概述了IS的病理机制、外泌体的生物发生和生化组成以及外泌体的分离方法。我们重点关注外泌体在调节病变部位有害微环境和促进IS神经再生方面的潜在作用。我们讨论了外泌体在运动、远程缺血调节和电针中的作用，以及外泌体在药物输送和血管内支架中的应用。最后，我们探讨了用于靶向输送的外泌体的设计策略和IS的给药途径。本综述将通过基础科学和临床医学研究成果的结合，全面了解外泌体在IS中的治疗作用，旨在促进基于外泌体的下一代IS治疗平台的进一步重大进展。

搜索策略

在本叙述性综述中，我们利用 PubMed 数据库检索了从建立到 2023 年 12 月 19 日发表的相关文章。文献检索使用一系列搜索词 (MeSH 术语) 和各种组合进行，以提高搜索的特异性和敏感性：外泌体、中风、缺血性中风、炎症、神经发生、运动、电针、支架和工程。我们排除了与我们的主题无关的文章，主要选择了过去 5 年的文章来展示该领域的最新研究进展。

图1显示了与IS相关的外泌体的文献来源时间线。

图1. 外泌体与缺血性中风相关文献来源的时间线。外泌体于 1983 年首次发现，已成为细胞间通讯的重要介质。近年来，它们对缺血性中风的潜在治疗作用已得到广泛研究。这些作用包括抗炎、抗凋亡、自噬调节、血管生成、神经源性和减少神经胶质疤痕形成。研究人员研究了各种治疗策略，包括运动、RIC 和 EA。这些方法旨在刺激外泌体的释放，从而发挥神经保护作用。随着我们对外泌体的了解不断加深，它们越来越多地被设计用于药物输送目的。例如，2020 年报道了依达拉奉与外泌体的整合，随后 2023 年报道了 tPA。此外，Hu et al. (2021) 推出了一种创新的外泌体洗脱支架，为 IS 治疗提供了一条有希望的新途径。EA：电针；RIC：远程缺血调节；tPA：组织纤溶酶原激活剂。

缺血性中风的发病机制

IS是由血管堵塞引起脑供血不足，导致局部脑组织缺血、缺氧坏死，进而出现神经功能障碍。脑是一个代谢活跃的器官，虽然体积小，但却能消耗全身四分之一的能量供应。当脑发生缺血缺氧时，缺血区域会诱发一系列有害的级联反应，包括线粒体功能障碍、钙超载、活性氧（ROS）生成、兴奋性神经递质增多、炎症细胞浸润，最终导致脑细胞凋亡和死亡（图2）。

图2. 缺血性中风的病理机制。缺血缺氧诱导线粒体功能障碍、钙超载、ROS 产生、兴奋性神经递质生成和炎症细胞浸润，导致脑细胞凋亡和死亡。向上箭头表示增加，向下箭头表示减少。BBB：血脑屏障；CAM：细胞粘附分子；ROS：活性氧。

具体而言，缺血缺氧导致线粒体功能障碍，进而介导ATP减少，Ca 2+从线粒体和内质网流入细胞内液。这个过程也会产生大量的ROS。ROS的过量产生会增加谷氨酸等兴奋性氨基酸的释放。谷氨酸进入细胞后，Na +和Ca 2+离子流入细胞，导致大量Cl-和水分子进入细胞，导致肿胀或水肿。脑细胞在缺血缺氧后会释放与损伤相关的分子模式，引发炎症级联反应。神经胶质细胞（主要是小胶质细胞和星形胶质细胞）被激活并释放多种炎症细胞因子，例如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-6、干扰素γ（INF-γ）和IL-1β。同时，炎症介质刺激内皮细胞上调细胞粘附分子（CAM）的表达。随后，来自外周的大量中性粒细胞和淋巴细胞渗入脑组织，在那里它们不断分泌炎症细胞因子，进一步损害BBB。局灶性脑缺血引起的生化变化导致永无止境的恶性循环，最终导致神经元死亡。值得注意的是，梗死核心区缺氧、缺葡萄糖、缺 ATP 是不可逆的。然而，缺血核心区与正常组织之间存在过渡区（缺血半暗带），该区域的组织损伤是可逆的。因此，开发一种有效的方法来保护和拯救缺血半暗带内的细胞至关重要。

外泌体概述

外泌体的生物发生

外泌体是一类细胞外囊泡 (EV)，直径范围为 40 至 160 nm，可由大多数细胞类型分泌。EV 主要根据其生物发生进行分类，分为三种亚型：外泌体、凋亡小体和微泡。与通过从细胞膜出芽形成的凋亡小体和微泡不同，外泌体是通过内溶酶体途径产生的。提出外泌体生物发生机制概念的研究人员从早期研究成熟网织红细胞分泌转铁蛋白受体的研究中获得了灵感。随着时间的推移，这种理解逐渐加深，这一点从 Johnstone (1992) 和 Record 等人 (2011) 的贡献中可以看出。

外泌体生物发生的典型过程包括以下步骤。首先，质膜内陷形成杯状早期分选内体 (ESE)，其中包含来自细胞表面和细胞外环境的一些特殊蛋白质。高尔基体网络和内质网促进 ESE 的形成，ESE 逐渐成熟为多囊泡体 (MVB)，MVB 是通过内体膜向内出芽形成的，包含许多腔内囊泡 (ILV)。随后，这些富含 ILV 的 MVB 通过与自噬体和溶酶体融合而经历降解途径。或者，它们通过与质膜融合将外泌体释放到细胞外空间。

外泌体的生化组成

外泌体的组成赋予了基于外泌体的纳米平台特殊的生物学特性，能够影响邻近或远处的细胞。因此，全面了解它们的生化组成至关重要。根据最新的外泌体数据库，外泌体可包含 9769 种蛋白质、1116 种脂质和 2838 种微 (mi)RNA。这些物质通过参与各种信号通路在生理和病理过程中发挥关键作用。外泌体蛋白质组显示，膜运输相关蛋白，如四跨膜蛋白 (CD63、CD9 和 CD81)，通过凋亡相关基因 2 相互作用蛋白 X 和转运依赖性途径所需的内体分选复合物被募集到外泌体。此外，外泌体富含肿瘤易感基因 101、热休克蛋白 Hsp60 和 Hsp90 以及整合素。Kamerkar et al. (2017) 报告称，外泌体上 CD47 的存在有助于它们通过单核细胞逃避吞噬作用，从而延长其在循环中的半衰期，为基于外泌体的纳米技术用于先进疗法提供了新的见解。外泌体的脂质含量包括胆固醇、磷脂酰丝氨酸和糖鞘脂。然而，外泌体中这些成分的比例与母细胞中的比例不同。这些成分有利于外泌体的刚性和稳定性，确保外泌体货物不易降解。miRNA 是基因表达的重要转录后介质，通过调节大量生物过程发挥作用，外泌体中也富含 miRNA。例如，外泌体 miR-146a-5p 可以通过下调 AKT/ERK 信号通路来抑制异常眼部新生血管。显然，更好地了解外泌体的生化组成可以增加基于外泌体的纳米平台在不同治疗模式中的多功能性。

外泌体分离技术

研究人员需要更深入地了解不同的外泌体分离技术（表1），因为收获高纯度和高产量的外泌体将有助于基于外泌体的诊断和治疗纳米技术的发展。超速离心、沉淀和超滤是广泛使用的外泌体分离方法。根据一份关于当前和新兴外泌体分离技术的报告，超速离心是最广泛使用的方法 (>80%); 然而，它很耗时，需要大量的样本。新的基于沉淀的商业产品正在迅速涌现，其特点是易于使用; 然而，一个明显的限制是它们的纯度低。尽管超滤比其他方法更快，并且不依赖昂贵的设备，但污染蛋白很难去除。随着技术的快速发展，已经设计出几种新的外泌体分离方法，效率有所提高。Lee 等人（2015）设计了一种先进的声学纳米过滤系统，可以以非接触的方式纯化外泌体，Rho 等人（2013）开发了一种磁性纳米传感器，可以分析红细胞衍生的外泌体。从临床角度来看，设计基于外泌体的递送系统的目标是通过合理的临床转化来预防或治疗疾病。因此，应该投入更多的精力来寻找或设计更方便、更有效的分离方法，以提供高纯度的外泌体，进一步满足临床要求。

表1. 外泌体处理技术总结

外泌体对缺血性中风的治疗作用

外泌体在脑卒中治疗中具有巨大的潜力（图3）。其生物学功能主要通过两种方式用于脑卒中治疗：（1）直接作用，即外泌体表面特异的蛋白质识别靶细胞受体，介导生物信号转导；（2）间接作用，即外泌体被靶细胞内化后，通过运送其固有物质（如蛋白质和核酸）发挥生物活性。外泌体参与脑卒中的一系列修复活动，包括抗炎、抗凋亡、自噬调节、血管生成、神经生成和减少胶质瘢痕形成（表2）。

图3. 缺血性中风后外泌体的神经保护机制。外泌体通过与缺血区域的细胞直接或间接通讯，具有关键的抗炎、抗凋亡、自噬调节、血管生成、神经发生和减少神经胶质疤痕形成的作用，并有助于中风后的功能恢复。

表2. 外泌体对缺血性中风的潜在治疗作用

具有抗炎作用的外泌体

炎症是卒中后的重要事件，涉及多种细胞类型和细胞因子，值得高度关注。尽管神经炎症有助于卒中后特定阶段的重塑和修复，但长期且不受控制的炎症会导致继发性脑损伤，例如 BBB 破坏、神经元损伤和血管老化。因此，控制炎症是卒中治疗的关键目标。

小胶质细胞是最初渗入 IS 部位的原发性炎症细胞。外泌体可通过调节小胶质细胞释放生物活性物质发挥抗炎作用。例如，富含 miR-146a-5p 的间充质干细胞 (MSC) 衍生的外泌体通过靶向白细胞介素-1 受体相关激酶 1 和活化 T 细胞核因子 5 来降低小胶质细胞释放的促炎介质（如单核细胞趋化蛋白-1 和诱导型一氧化氮合酶）的水平。此外，MSC 衍生的外泌体 miR-145 降低了氧葡萄糖剥夺/再灌注刺激的 BV2 细胞中小胶质细胞释放的促炎因子水平。除了小胶质细胞的产物外，星形胶质细胞释放的炎症细胞因子在 IS 相关神经炎症中起着重要作用，并提供了有希望的治疗靶点。Song 等人 (2019a) 发现皮质神经元衍生的外泌体通过 miR-181c-3p 下调星形胶质细胞中 CXCL1 和炎症细胞因子的表达，从而减轻了 IS 后的炎症。

激活的小胶质细胞和星形胶质细胞会释放趋化因子，募集外周免疫细胞至受损脑组织。浸润的免疫细胞进一步激活炎症级联，导致更多小胶质细胞和星形胶质细胞被激活，最终导致神经元细胞死亡。因此，除了直接抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的激活外，减少外周免疫细胞对脑组织的浸润对于中风的抗炎治疗至关重要。Song et al.发现含有 miRNA-181c-3p 的皮质神经源性外泌体下调了星形胶质细胞中 CXCL1 的表达，进一步减少了浸润脑组织的外周免疫细胞数量。近期，Wang et al.证明 MSC 衍生的外泌体通过减少各种类型的白细胞（尤其是中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞）的浸润，在年轻和老年小鼠的缺血性脑组织中发挥神经保护作用。虽然确切的机制尚不完全清楚，但外泌体调节免疫反应和减少外周炎症细胞浸润的能力为探索针对缺血性脑损伤的治疗策略开辟了新途径。

肠道菌群及其代谢产物是外周免疫系统的重要组成部分。由于肠道内有成千上万的共生菌，这些菌群不断使胃肠道免疫系统接触细菌抗原，因此胃肠道是人体最大的免疫细胞区室之一。越来越多的证据表明，肠道菌群可以通过脑肠轴影响大脑，IS 后也可能出现肠道菌群失调。卒中后，有益菌数量和多样性的减少通常伴随着机会菌数量和种类的增加，而这种肠道菌群失调会加剧神经炎症和免疫活动。有报道显示小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）6小时后胃肠动力明显下降，并伴有肠上皮坏死脱落，24小时后症状进一步加重。同时，肠道淋巴细胞可浸润脑组织，加剧缺血性损伤。Benakis等（2016）研究发现，与携带耐药菌群的抗生素治疗小鼠相比，接受阿莫西林/克拉维酸治疗的携带抗生素敏感菌群的MCAO小鼠梗死体积减少了（60±6）%。此外，据报道，源自人胎盘间充质干细胞的外泌体可通过调节肠道微环境改善心肌梗死，这为开发用于中风治疗的外泌体提供了新的方向。最近，Sun 和 Xu（2023）提出，来自 MSC 衍生外泌体的 miR-150-3p 可以调节肠道微生物群的丰度和多样性，包括变形菌和不动杆菌。他们随后进行了粪便微生物群移植，并观察到肠道微生物群介导的 MSC 衍生外泌体减轻了神经炎症和细胞凋亡。因此，外泌体可以通过调节肠道微环境成为一种有前途的中风抗炎疗法。

具有抗凋亡和自噬调节作用的外泌体

缺血后，脑组织供血不足，导致氧、糖、ATP水平下降，最终导致细胞死亡。在梗死核心区，氧、糖、ATP缺乏是不可逆的，导致细胞坏死。但缺血半暗带是可逆的，发展缓慢，可持续数小时，为抢救细胞、限制梗死体积提供了时间和机会。因此，抢救半暗带中的细胞已成为当前临床治疗讨论的重点。

半暗带内的脑细胞包括神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞等，越来越多的证据表明，来源于细胞的外泌体可以抑制脑细胞凋亡，有助于减轻脑缺血模型中的缺血/再灌注损伤。

细胞凋亡途径包括线粒体介导的内在途径和受体介导的外在途径，二者均由一组胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶（caspases）调控。近期，Luo等（2022）发现NSC衍生的外泌体（NSC-Ex）富含miR-150-3p，作者筛选出靶基因caspase-2（CASP2）。MCAO小鼠模型接受NSC-Ex或miR-150-3p治疗后，抗凋亡的Bcl-2水平升高，而促凋亡的Bax和caspase-3水平降低。NSC-Ex抑制了MCAO小鼠模型中的神经元凋亡，减少了梗死面积。BMSC 来源的外泌体通过 miR-134 下调 caspase-8 的活性和表达来抑制少突胶质细胞凋亡，这可能是 IS 的一个新的潜在治疗靶点。Deng et al.表明中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 (LCN2) 参与细胞凋亡，是 miR-138-5p 的靶基因。BMSC 来源的外泌体 miR-138-5p 通过下调 LCN2、Bax 和 caspase-3 水平来抑制星形胶质细胞凋亡。miR-26a-5p 是一种新发现的外泌体 miRNA，在许多疾病中发挥重要作用，miR-26a-5p 可抑制心肌细胞凋亡。此外，Cheng 等人 (2021) 证明 MSC 衍生的外泌体分泌的 miR-26a-5p 可以通过下调 CDK6（G1 细胞周期激酶）来防止小胶质细胞凋亡并减轻脑损伤。

自噬是一种细胞分解代谢过程，涉及细胞内成分（如受损细胞器、错误折叠的蛋白质和细胞内病原体）的回收和降解。该过程受到严格调控且动态变化，在维持细胞稳态和适应各种应激条件下起着至关重要的作用。越来越多的证据表明，自噬在各种细胞类型中都被激活，包括神经元和神经胶质细胞，这强调了自噬在 IS 中的重要作用。此外，适度诱导自噬有助于提高细胞活力并减少梗塞面积。“Nampt”又称烟酰胺磷酸核糖转移酶，在脑缺血损伤过程中对自噬的调控起着重要作用。在氧葡萄糖剥夺/复氧刺激的星形胶质细胞（OGD/R-ADEXs）来源的外泌体中，Nampt的表达也显著增加，OGD/R-ADEXs分泌的Nampt可以通过激活AMPK、抑制mTOR的磷酸化来诱导自噬，从而改善急性IS。因此，适度诱导自噬可能是卒中治疗的新策略。然而，自噬对于IS后神经元的存活来说是一把双刃剑。不受控制的自噬会导致重要细胞器的破坏，导致细胞降解和循环机制失衡，最终导致细胞死亡。

外泌体在抑制IS中的自噬方面也发挥着重要作用。例如，星形胶质细胞来源的外泌体通过miR-190b靶向自噬相关基因7来抑制自噬，从而抑制细胞凋亡并发挥神经保护作用。Kuang et al. (2020) 表明，外泌体调节过度激活的卒中后自噬活性有助于神经保护。他们发现来自脂肪间充质干细胞 (ADMSCs) 的外泌体将 miR-25-3p 转移到靶细胞，并通过抑制 p53/BNIP3 信号通路来抑制自噬。因此，外泌体在调节卒中微环境中的自噬方面发挥着重要作用。

具有血管生成作用的外泌体

血管生成通过增强受损神经元的代谢能力、协助神经元重塑和神经干细胞的迁移、清除坏死的脑组织碎片等方式，有助于神经功能的恢复。血管生成是一个复杂的过程，涉及一系列重要因子的相互作用，包括VEGF、VEGFR2、Ang-1和Tie-2。当VEGF与VEGFR2结合时，会触发下游信号通路，促进内皮细胞增殖和迁移，最终形成新的血管。然而，由于缺乏血管周围周细胞和细胞外基质的支持，新生血管不够稳定。为了进一步促进这些新生血管的成熟，需要Ang-1和Tie-2之间的相互作用。Hu et al. (2022) 研究表明，来自 BMSCs 的外泌体可增加缺血半暗带中 VEGF、VEGFR2、Ang-1 和 Tie-2 的表达，并通过 miR-21-5p 增加微血管密度。同样，在向 2 型糖尿病卒中小鼠模型静脉注射内皮细胞来源的外泌体后，脑微血管密度和毛细血管形成增加，这种效应是由 miR-126-3p 介导的。然而，促血管生成因子（如 VEGF 和 HIF-1）的过度表达会破坏紧密连接蛋白，导致 BBB 通透性增加，并增加不良事件的风险。因此，需要进一步探索外泌体维持血管生成稳态的能力。

具有神经发生作用的外泌体

脑梗死后，轴突生长受限，梗死区域周围的轴突数量减少。轴突重塑是神经功能自发改善的关键步骤。外泌体，尤其是来自干细胞的外泌体，由于其具有多种分化潜能和可塑性，在轴突的发育和再生中起着重要作用。富含 miR-17-92 的 MSC 衍生外泌体可通过激活 PI3K/Akt/mTOR 通路促进轴突生长和髓鞘形成，并有助于中风后的神经功能恢复。然而，研究最深入的干细胞来源有限，例如骨髓间充质基质细胞 (BMSC) 和 ADMSC，并且这些细胞的分离需要侵入性方法，这对其临床应用造成了重大障碍。最近，研究人员在该领域取得了重大突破，成功从尿液中分离出一种新型干细胞。尿液干细胞（USC）产生的外泌体通过 miR-26a/HDAC6 轴促进神经再生。因此，尿液可以为 IS 的治疗提供一种新的、方便的外泌体来源。除了干细胞来源的外泌体外，Jin et al. (2023) 发现星形胶质细胞外泌体的表面蛋白 HepaCAM 可以通过独特的表面接触机制诱导轴突生长。此外，Zhang et al. (2020b) 发现来自缺血性脑内皮细胞的外泌体通过增加受体神经元中 miRNA 和靶蛋白的表达来促进轴突生长。因此，外泌体在神经发生和促进 IS 后的神经功能恢复方面具有潜在用途。

具有减少胶质疤痕形成作用的外泌体

神经功能的恢复不仅依赖于神经元的存活和再生，还依赖于胶质细胞。卒中周围区域有大量胶质细胞增生并形成致密的胶质瘢痕，而瘢痕是轴突再生的主要障碍，因此促进胶质细胞降解、抑制胶质细胞形成有利于神经功能的恢复。信号转导和转录激活因子3（STAT3）在星形胶质增生中起关键作用，并促进增生性星形胶质细胞的标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达，因此STAT3可作为卒中的干预靶点。小胶质细胞衍生的外泌体富含 miR-124，据报道，miR-124 可降低 STAT3 和 GFAP 的表达，并进一步抑制体内和体外星形胶质细胞的增殖和迁移。此外，Xin et al. (2023) 证实，缺氧小胶质细胞衍生的外泌体可抑制星形胶质细胞增殖并限制胶质瘢痕的形成。因此，使用外泌体可能是减少胶质瘢痕形成的有效方法。

外泌体在当前缺血性中风治疗中的作用

随着我们对外泌体在IS中抗炎、抗凋亡、调节自噬、促进血管生成、促进神经生成、减少胶质瘢痕形成等多种作用的认识逐渐加深，研究者对探索相关的新型治疗方法的兴趣日益浓厚。由于传统药物治疗效果不理想，越来越多的研究者开始关注运动、远程缺血调节（RIC）、电针等非药物疗法，但由于缺乏其疗效的理论基础，这些疗法尚未得到广泛应用。近年来，我们发现这些疗法可以通过外泌体发挥多种治疗作用，为IS治疗提供了新的见解和思路（图4）。

图4. 外泌体在运动、远程缺血调节和电针中的作用。运动、远程缺血调节和电针可以促进外泌体的释放，并通过外泌体实现各种治疗效果。向上箭头表示增加，向下箭头表示减少。HIF：缺氧诱导转录因子。

锻炼

运动是有效的非药物抗卒中方法，美国心脏协会明确推荐将运动作为卒中预防和治疗策略的一部分。适当的运动可以减少IS后的氧化损伤、神经炎症和细胞死亡，有助于减少梗死面积，诱导血管生成，促进神经发生。

外泌体是运动与卒中预防之间联系的重要因素，近年研究发现，外泌体的释放与Ca 2+内流增加密切相关。运动时，支配骨骼肌纤维的运动神经元受到刺激，促使Ca 2+从肌浆网释放到细胞质中。因此，人们认为，运动后，机体迅速释放外泌体进入循环系统，向组织传递信息，实验表明，适当的运动可以提高健康个体血液中外泌体的水平。有报道称，中风前或中风后的运动干预可增加 MCAO 大鼠或小鼠血清和脑组织中的外泌体含量，并通过外泌体发挥神经保护作用。

内皮细胞损伤是IS的一个重要致病结果。Ma等（2018）发现运动可增加健康小鼠的外泌体和miR-126水平，随后通过miR-126/SPRED1/VEGF通路保护内皮细胞免受损伤。后来，Wang等（2020b）研究了小鼠MCAO前4周运动干预的影响。他们发现卒中前适当的运动可增加MCAO小鼠血清和脑组织中外泌体和miR-126的水平。他们还观察到运动减轻了神经功能缺损，减少了梗塞体积，增加了微血管密度，促进了神经发生。这些影响背后的机制可能与外泌体中miR-126的释放增加有关。因此，外泌体可以改善康复计划并增强卒中治疗的前景。

在另一项研究中，Li 等人（2021 年）观察到，与单纯运动相比，外泌体和运动的联合疗法增加了 MCAO 小鼠脑组织外泌体的水平、突触数量和突触可塑性相关蛋白的数量，并减少了梗塞面积。这项研究进一步验证了运动通过外泌体发挥有益作用的事实，并提出了将外泌体与运动疗法相结合可能成为中风治疗新方向的可能性。

远程缺血调节

尽管运动已被证明是一种非常有效的卒中预防和治疗方法，但它往往导致患者参与度低。RIC 是一种通过激活内源性保护机制来提高对缺血和缺氧耐受性的临床方案。这是通过反复短暂地阻塞和再灌注远端肢体的血流来实现的，最终保护目标器官和组织。与运动相比，RIC 被动性可提高依从性，从而提高 IS 患者的康复率，使其成为替代或辅助卒中后运动疗法的非常有吸引力的干预选择。已对 IS 患者的 RIC 进行了多项大规模临床试验，并取得了令人鼓舞的结果。耿等 (2021) 已确定 RIC 和运动在神经保护作用方面存在许多重叠机制。

考虑到外泌体可以穿透血脑屏障并运送至大脑，它们代表了将RIC的神经保护信号从外周运送至中枢神经系统的潜在转运体。在健康个体的RIC和非RIC组之间发现了75种差异表达的外泌体蛋白，其中可可碱、载脂蛋白A1和血红素结合蛋白与卒中后的神经保护作用有关。这一发现增强了研究人员对外泌体在RIC介导的脑保护中的重要作用的信心，并进行了多项研究来验证这一点。例如，Li et al. (2019) 提出，与从非RIC治疗小鼠中提取的外泌体相比，从RIC治疗小鼠中提取的外泌体可以更好地减弱MCAO小鼠的梗塞体积并改善神经系统症状。此外，RIC 治疗小鼠释放的外泌体含有较高水平的缺氧诱导转录因子 1 (HIF-1α)，可以将 HIF-1α 转移到缺血脑组织或上调受损脑细胞中的 HIF-1α，从而发挥神经保护作用。Cui 等 (2020) 发现 RIC 后血管内皮细胞释放的外泌体富含 miR-126，它通过靶向 DNMT3B 降低 LINE-1 和 Alu 甲基化水平，从而提高神经元对缺血和缺氧的耐受性。RIC 也有利于外泌体的释放，这可能涉及缺氧激活 HIF 信号通路。因此，外泌体在 RIC 介导的脑保护中起着至关重要的作用，并可能为 IS 中的 RIC 治疗提供新的机制。

电针疗法

数千年来，针灸一直用于治疗各种疾病。电针 (EA) 是一种现代针灸形式，通过细针施加类似于人体生物电的小电流来刺激特定的穴位。世界卫生组织已推荐 EA 作为预防和治疗 IS 的替代或补充疗法。EA 促进神经发生和血管生成，缓解功能性神经功能缺损，并减少梗塞面积。

电针是一种常见的电刺激形式，可通过影响 Rho GTPase、Rab 家族成员和 Ca 2+水平来增加外泌体的释放。Zhang 等 (2020a) 的研究表明，电针刺激后，IS 梗死周围区域的外泌体含量增加。同时，电针可增加外泌体中 miR-146b 的含量，从而促进 NSC 分化并实现神经发生。Xu 等 (2022) 发现电针疗法通过外泌体 miR-210 激活 HIF-1/VECF/Notch1 信号通路，在 MCAO 大鼠模型中发挥血管生成作用。这些发现为电针的临床应用提供了新的理论基础，并为针灸在现代医学领域的益处提供了关键证据。

基于外泌体的缺血性中风疗法

目前临床上IS的治疗方法通常包括药物治疗（如溶栓药物、神经保护药物）和血管内支架治疗，但这些疗法疗效有限且副作用不可避免。多年来的研究表明，外泌体在临床应用方面有着良好的前景。进一步探索外泌体与IS临床治疗的结合，将有助于减少现有药物和支架治疗的副作用，开发出更多创新有效的治疗方法，为IS患者提供更合适的临床治疗选择（图5）。

图5. 基于外泌体的缺血性中风疗法。将外泌体与药物结合可以提高药物的稳定性、效率和生物利用度，并减少副作用。与支架结合时，外泌体可以促进内皮生长并降低支架内再狭窄的风险。使用 Microsoft PowerPoint 2021 创建。向上箭头表示增加，向下箭头表示减少。tPA：组织型纤溶酶原激活剂。

外泌体在药物输送中的作用

外泌体是细胞分泌的囊泡，可携带miRNA、蛋白质、核酸、脂质等物质在细胞间传递信息。此外，外泌体腔内和表面富集的各种磷脂和蛋白质成分可帮助实现药物负载，从而提高药物的稳定性、疗效和生物利用度，并降低毒副作用。与其他合成纳米材料相比，外泌体具有免疫原性低、稳定性好、半衰期长等特点，有望成为安全有效的药物载体。

溶栓药物

由于血栓形成极有可能导致IS，目前的卒中指南推荐组织型纤溶酶原激活剂（tPA）作为治疗IS最有效的药物之一。tPA通过与纤维蛋白结合并最终降解纤维蛋白，将纤溶酶原转化为纤溶酶，并可穿透BBB进入脑实质，从而导致脑出血。因此，理想情况下，tPA应该被递送到血栓栓塞部位，而不是到达脑实质。为了实现tPA的精准递送至血栓部位并延长其半衰期，研究人员尝试使用外泌体作为载体。最近，Khalil 和 Kanapathipillai (2023) 开发了一种外泌体包覆的 tPA 纳米制剂，用于溶栓治疗。外泌体 tPA 表现出比游离 tPA 更高的稳定性，并且包裹在外泌体中的 tPA 的活性不受纤溶酶原激活剂抑制剂干预的影响。此外，外泌体与 tPA 之间的结合导致颗粒尺寸更大，这意味着更少的 tPA 可以穿透脑实质，从而降低脑出血的发病率。

神经保护药物

对于错过溶栓时间窗的患者，临床建议使用神经保护药物来减缓病情进展。脑损伤部位在缺血缺氧后会释放大量氧自由基，导致神经功能进一步受损。依达拉奉是临床成熟的神经保护药物，能清除氧自由基、抑制细胞过氧化物、减少细胞损伤，但其半衰期短、不易穿过血脑屏障、生物利用度低、大剂量时有肾脏损害等特点，限制了其应用。针对这些问题，Li等（2020）将依达拉奉装载到巨噬细胞来源的外泌体（Exo+Edv）中，发现Exo+Edv提高了依达拉奉的生物利用度，减少了神经元损伤和梗死面积，并发挥了神经保护作用。血浆来源的外泌体具有天然的脑靶向能力，该能力通过脑内皮细胞中的转铁蛋白受体与外泌体上表达的转铁蛋白相互作用而介导。Gao等 (2021) 将依达拉奉装载到血浆来源的外泌体中；与游离依达拉奉相比，装载依达拉奉的外泌体表现出更好的脑靶向性、更高的安全性和生物利用度，并且其作用减少了卒中急性期的梗塞面积。

载有溶栓药物和神经营养药物的外泌体的治疗效果已得到初步证实，但临床治疗中患者对外泌体可能产生的不良反应尚不明确，需要大规模临床试验验证其可行性，但总体而言，基于外泌体的药物递送系统在IS治疗中具有良好的应用前景。

外泌体在血管内支架治疗中的作用

静脉溶栓和机械取栓是IS的强烈推荐治疗方法，但由于治疗时间窗短，其应用受到限制。对于大血管闭塞患者，由于血管变窄，即使溶栓或取栓后仍可能发生再次闭塞。机械取栓失败的主要原因是颅内动脉粥样硬化狭窄。因此，血管内支架置入是IS患者的一种可选治疗策略。裸金属支架植入血管后，平滑肌细胞增殖并迁移到受损部位，导致支架内再狭窄。为了解决这一问题，药物洗脱支架已经开发出来，减少了支架内再狭窄的发生。然而，洗脱药物也会延迟支架内皮细胞的覆盖，延迟动脉愈合，增加晚期血管再狭窄的可能性。因此，需要寻找新的血管内支架洗脱药物。

外泌体具有低免疫原性、稳定性和固有生物活性，是极有前途的洗脱药物候选物。例如，来自人脐带间充质干细胞的外泌体可通过 miR146a-5p 发挥抗炎作用；而 MSC 衍生的外泌体 let-7b-5p 和 miR-23a-3p 可以靶向与血管修复和生成相关的基因。MSC 衍生的外泌体还含有许多与血管生成相关的蛋白质，例如胶原蛋白 α1 和纤连蛋白。基于上述功能，外泌体已被视为治疗 IS 的潜在支架涂层。最近，Hu 等人(2021) 开发了一种生物响应性外泌体洗脱支架，为了防止治疗过程中外泌体过早耗尽，他们在外泌体和支架之间添加了可对ROS作出反应的经过修饰的可生物降解“连接物”。在缺血-再灌注损伤下，产生的大量ROS可加速外泌体从支架中释放，然后通过血管到达受损部位。与药物洗脱支架相比，外泌体洗脱支架可加速内皮细胞再生并降低支架内再狭窄的风险。因此，新兴的外泌体纳米技术有望改善支架植入。

外泌体来源于细胞，具有与细胞膜相似的磷脂双层结构，因此当外泌体以共价键合的方式结合到金属支架表面时，可以有效伪装其外来属性，避免免疫系统的攻击。此外，外泌体中含有多种具有抗炎、抗凋亡、血管生成等作用的活性物质，而外泌体管腔和表面丰富的多种磷脂和蛋白质成分是药物负载的重要基础。因此，多种药物可以通过外泌体负载到支架上，在扩张血管的同时，达到治疗效果的互补。

缺血性中风外泌体靶向递送的工程策略

基于外泌体的中枢神经系统疾病治疗策略不断涌现，但单纯的外泌体对缺血病变部位的靶向性尚不充分，因此，通过靶向缺血病变部位的特定细胞类型来提高外泌体的特异性已成为优化其治疗效果的关键步骤。

外泌体靶向的经典方法是通过基因工程将特定细胞的肽融合到外泌体的膜上。例如，将特异性结合乙酰胆碱受体的神经元特异性狂犬病毒糖蛋白 (RVG) 与树突状细胞衍生外泌体的溶酶体相关膜糖蛋白 2b 融合，导致其在神经元内靶向聚集。静脉注射载有 GAPDH 短干扰 (si)RNA 的 RVG 注入外泌体后，在神经元中观察到特定基因敲除，但在肝脏、脾脏、肾脏或其他器官中未观察到。随后，类似的方法被用于将不同的 siRNA 和 miRNA 递送到 IS 中的病变部位。此外，还制备了一种重组靶向肽，该肽含有与乳粘素的 C1 和 C2 结构域融合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸 (RGD)-4C 肽 (ACDCRGDCFC)，可与外泌体膜上的磷脂酰丝氨酸结合。这些工程化的外泌体还显示出靶向缺血性脑损伤区域的能力。虽然基因工程是改造外泌体的一种非常可行的策略，但在外泌体膜上表达靶向配体可能会影响其他膜蛋白的原始生物活性。

另一种靶向策略是化学和物理相结合，利用点击化学将对缺血灶部位脑血管内皮细胞整合素αvβ3具有高亲和力的环（Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys）肽[c（RGDyK）]偶联到MSC衍生的外泌体表面。将上述表面功能化的外泌体静脉注射到短暂性MCAO小鼠模型中后，免疫荧光和近红外荧光成像显示在缺血灶部位外泌体明显富集，并且在小胶质细胞、神经元和星形胶质细胞中也发现了外泌体。此外，鉴于甘露糖对小胶质细胞上表达的甘露糖受体具有选择性结合亲和力，研究人员设计了甘露糖结合的外泌体，在IS中表现出优异的小胶质细胞靶向性。与基因工程相比，化学修饰更具成本效益，适合大规模生产。然而，化学修饰过程中存在潜在风险，即化学修饰可能会使外泌体表面蛋白失活。

磁导航也已用于脑内注射治疗研究。为了增强外泌体的靶向能力，氧化铁纳米粒子已被装载到外泌体中，导致磁性纳米囊泡在外部磁场的引导下在脑内聚集。通过施加磁场，可以提高治疗性外泌体的递送效率，并延长其在靶器官内的停留时间。然而，由于人体结构的复杂性，磁导航可能并不适用于所有器官。这些研究通过巧妙的改造或纳米工程赋予外泌体卓越的靶向能力，以提高其治疗效果。探索和开发更合适的靶向策略已成为研究人员的必然趋势，旨在最大限度地发挥外泌体的治疗潜力。

外泌体的给药途径

外泌体给药方式有多种，已进入临床前及临床试验阶段。静脉注射外泌体是最普遍接受的技术。但其主要限制是肺部首过效应，外泌体还会富集于肝脏、肾脏和脾脏，这表明脑部病变部位的外泌体数量不足。动脉内注射可导致其更高程度的蓄积，但可能导致动脉内和脑微血管栓塞的形成。虽然一些侵入性更强的方法，如脑内和鞘内注射，可使大量外泌体到达病变部位，但感染风险也会增加。鼻腔给药途径越来越受到关注，因为它往往能达到令人满意的脑内蓄积，与静脉给药相比具有显著优势。值得注意的是，鼻腔给药外泌体可以穿过血脑屏障，这一现象得到了体内神经影像学的支持。然而，目前还没有研究对不同给药方法在 MCAO 小鼠模型中的功能效率进行比较分析。为了进一步改善外泌体在脑内靶位的分布，应该更多地通过生物工程改造外泌体，克服传统给药方法的缺点。

限制

目前，我们对外泌体的了解仍处于起步阶段，需要解决许多限制。一个主要障碍是目前可用的耗时分离技术效率低下，这阻碍了外泌体的商业化和临床应用。一个重大挑战在于外泌体（范围从 40 到 160 纳米）和 EV 的另一个子类（称为微囊泡）（100-1000 纳米）之间的粒径重叠，因为缺乏有效的分离方法来分离这些颗粒。此外，不同的分离方法可能会影响样品的表征（例如形态和电位）。细胞培养条件和工程改造也可能影响外泌体的生化和生物物理特征。由于外泌体的异质性，批次间差异存在不确定性。此外，有人担心外泌体的基因工程或化学/物理改变可能导致潜在的功能损害。此外，我们对外泌体生物学的基本知识和理解仍然不足且处于初步阶段，特别是关于外泌体内化的机制及其在体内的药代动力学和药效学表现。外泌体被认为是有前途的生物标志物，因为它们含有蛋白质和其他生物分子，如DNA、miRNA、长链非编码RNA和环状RNA，并且已经开发出各种生物传感器来检测它们；然而，这些方法的灵敏度通常会因样本中存在大量核酸或细胞而受到阻碍。

结论和未来展望

是全球范围内导致长期残疾和死亡的主要原因。其复杂的发病机制和病理微环境导致临床实践中缺乏有效的治疗方法。近几十年来，研究人员在增加对外泌体的生物发生、生化组成和生物学功能的认识方面取得了很大进展。越来越多的证据表明，外泌体在卒中的预防和恢复中起着关键作用，被认为是潜在的治疗策略。

在本综述中，我们回顾了外泌体的生物发生、生化组成和当前的分离技术，这可能有助于临床研究人员更好地了解外泌体。我们总结了外泌体在IS中的多种治疗功效，例如抗炎、抗凋亡、自噬调节、血管生成、神经再生和减少神经胶质瘢痕形成。此外，我们描述了外泌体与运动、RIC和电针等当前IS疗法的效果密切相关，这可能有助于临床研究人员进一步了解这些疗法。基于外泌体的药物递送系统和外泌体洗脱支架的研究也为临床研究人员提供了新的见解。纳米技术的快速发展推动了工程化外泌体的进化，可有效提高靶向能力，增强治疗效果，并减少所需药物剂量。

我们的综述认识到了基础科学与临床医学研究之间的密切联系，这有助于提供对外泌体的更全面的看法。更重要的是，这篇论文可能会鼓励跨学科研究，促进基于外泌体的 IS 疗法的发展。在目前 IS 的实验研究中，研究人员正在开发许多基于外泌体的疗法，这些疗法在临床前动物模型中表现出良好的安全性和治疗益处，这归因于它们的高生物相容性和在治疗货物中的富集。因此，外泌体显示出巨大的临床转化潜力。最近，Aruna Bio, Inc.（神经外泌体疗法开发的先驱）宣布，美国食品和药物管理局已批准其外泌体产品作为其 1b/2a 期 IS 临床试验的试验性新药。此外，几项正在进行的临床试验已在 ClinicalTrial.gov 上注册，我们期待他们的研究结果。例如，临床试验 NCT03384433 旨在评估 MSC 衍生的外泌体对 IS 患者的治疗效果。在另一项临床试验（NCT06138210）中，人类诱导性多能干细胞衍生的外泌体被用于安全性和初步疗效的评估。此外，临床试验 NCT05370105 正在评估外泌体对 IS 患者的预后能力。鉴于该领域缺乏临床证据，外泌体的治疗效果和安全性需要进一步探索。

为了增进对外泌体的了解并探索其在 IS 治疗中的潜在应用，我们必须专注于开发更精确、更通用的分离技术以及改进的下游纯化方法，以获得适合有效治疗用途的高质量外泌体。外泌体的详细表征（定量和定性）也至关重要。为此，需要先进的技术，以及设计统一的工作流程和外泌体分离和表征标准，包括形态、直径、zeta 电位和标记物。不符合这些标准的样品可能需要额外的处理步骤来提高其纯度。此外，外泌体的稳定性也是一个关键考虑因素。储存条件（例如 4°C 或 –80°C 温度）会影响外泌体的特性，并可能导致蛋白质组内容的丢失。因此，探索最佳储存条件也至关重要。纳米技术专家、基础科学家、生物医学科学家以及研究基于外泌体的 IS 疗法的研究人员之间的合作努力将有助于不断创新和革新传统治疗方法。